Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue

硬組織線粒體分離試劑盒

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基本描述

硬組織線粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue）是一款快速便捷的分離動物硬組織（如：骨骼肌）線粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線粒體的同時，還能獲得不含線粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞se素c等線粒體蛋白向胞漿的釋放。經本試劑盒獲得的大部分線粒體都含有完整的內膜和外膜，且維持線粒體生理功能，因此，分離所得的線粒體可用于線粒體膜電位等生理功能相關研究。另外，分離得到的線粒體也可被線粒體裂解液或其它適當裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

本試劑盒適用于從動物硬組織（比如：心肌、骨骼肌）或其他難以分離線粒體的組織中提取線粒體。

產品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 進行實驗之前務必閱讀試劑盒操作流程，根據最終實驗目的選擇試劑盒內所要用到的試劑。

2） 若不是用于制備線粒體蛋白樣品，不必往線粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3） 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進行，所用溶液需冰浴或4℃預冷，全部操作時間盡量控制在1h之內。

4） 通常，在分離線粒體時前后兩次離心速度選取1000g和12,000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5） 試劑開封后請盡快使用，以免影響后續實驗效果。

6） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

自備材料

1）（可選）BCA蛋白定量檢測試劑盒或Bradford蛋白濃度測定試劑盒

2）尼龍網或細胞篩

3）低速離心機

4）勻漿器

使用方法

1. 試劑準備：從冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果實驗目的是為了制備線粒體蛋白樣品，需在線粒體裂解緩沖液和清洗液內添加PMSF (100×)，使其終濃度為PMSF (1×)。PMSF一定要在試劑加入到樣品前1-2min內加入，以免PMSF在水溶液中失效。

2. 清洗：動物禁食24h后處死，取新鮮橫紋肌等組織（不宜采用凍存組織），迅速稱重50~100mg，用預冷的清洗液清洗2次，棄清洗液，于冰上剪成30mm2大小的組織碎片。

3. 裂解：加入10倍體積預冷的線粒體裂解液，置于冰浴5-10min。

4. 勻漿I：轉移到預冷的Dounce勻漿器中，勻漿10-20次。或采用電動勻漿器，700rpm，8-10次。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數有所不同，需自行優化。【注意】：如果組織重量為100mg，可以粗略認為組織的體積接近100μl，此時需加入1000μl線粒體裂解液。

5. 勻漿II：4℃攪拌孵育5-10min。用等體積的線粒體儲存液稀釋至勻漿液，再次重復步驟4。

6. 離心：用尼龍網或細胞篩網過濾勻漿液，4℃ 1000g離心15min，重復1次，以去除細胞核、未破碎細胞和大的膜碎片。【注意】：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為2000g離心10min，缺點是相同數量細胞的線粒體抽提得率會下降。

7. 上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 12000g離心10min。【注意】：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為6000g離心10min，缺點是相同數量細胞的線粒體抽提得率會下降。

8. 棄上清，沉淀即為線粒體。【注意】：如果希望獲得去除線粒體后的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，且在收集上清的過程中不要觸及沉淀，隨后把收集的上清4℃ 12000g 離心10min，此時的上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。

9. 保存：棄上清，用適當的緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能分析，線粒體沉淀需重懸于線粒體保存液中；如果用于細胞漿蛋白的分析，獲得的細胞漿蛋白應保存于蛋白保存液（1×），即按照：細胞漿蛋白：蛋白保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應使用其它適宜的保存液。

【注意】：使用本試劑盒中的線粒體儲存液稀釋或儲存的線粒體樣品應及時使用，以免線粒體膜電位受影響。如果不能及時使用，建議在-80℃保存。凍存后的線粒體樣品不推薦用于膜電位的檢測，但可以用線粒體蛋白或核酸的相關檢測。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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